O sonhador Larry Daley (Ben Stiller) está longe de ser um homem bem-sucedido. Desempregado e prestes a ser despejado, ele descobre que seu filho não o tem mais como herói, e que admira o padrasto. Sem perspectivas, ele decide implorar por qualquer emprego, e, assim, é chamado para ser guarda noturno do Museu de História Natural. O trabalho não é bem o que desejava, mas ele decide tentar e passar Uma Noite no Museu.

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Porém, o que o novo vigia não contava era que as criaturas expostas no local ganhariam vida durante a noite, e seu trabalho, mais do que impedir que estranhos entrem, é impedir que algo saia errado. Desse modo, ele terá muito trabalho com Átila, o Huno, um dinossauro, alguns animais selvagens e ainda com miniaturas de cowboys que insistem em guerrear com miniaturas de soldados romanos. Para sobreviver a tudo e provar a seu filho que ele pode ser um grande homem, Larry contará com a ajuda do ex-presidente, de cera, Teddy Roosevelt (Robin Williams).

Para Uma Noite no Museu ser realizado foi preciso uma grande quantidade de efeitos especiais que pudessem dar vida a tantos elementos como ossos de dinossauros, leões, macacos e estátuas de pedra. Shawn Levy, o diretor, a princípio se sentiu intimidado com tantos efeitos, mas contou com o apoio dos produtores Chris Columbus e Michael Bamatham, que já haviam trabalhado em filmes como os da série de Harry Potter, e puderam tranqüilizá-lo.