No último filme da trilogia, Peter Parker (Tobey Maguire) é bastante diferente daquele garoto inseguro de quando foi picado por uma aranha, ganhando superpoderes. Nova Iorque ama o Homem-Aranha, e Peter adora ser amado pelo povo. Tanto que não percebe que sua namorada, Mary Jane (Kirsten Dunst), passa por problemas profissionais e se sente insegura ao seu lado. Enquanto a falta de autoconfiança daquele adolescente era um problema antes de virar um adorado herói, agora seu excesso que pode atrapalhar.

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Harry Osborne (James Franco), ex-amigo de Peter e filho do Duende Verde, decide assumir os poderes do pai, por vingança. Está disposto a destruir o Aranha, o que é um problema, já que este ainda o tem como amigo. Além disso, o assassino foragido Flint Marko sofre um acidente e se torna o Homem-Areia, um vilão com habilidades que deixam o herói em apuros. Mas, o pior de todos os inimigos está dentro do próprio Peter Parker, que se deixa dominar por uma substância alienígena capaz de controlar seus sentimentos e que dará origem a mais um grande vilão: Venom. Parker passará por grandes provações para enfrentar os três e reconquistar o coração de Mary Jane.

Retomando tudo o que havia sido deixado inacabado nos dois anteriores, em um tom bem mais sombrio, Homem-Aranha 3 fecha a trilogia sem deixar espaço para um quarto filme - que acontecerá mesmo sem Tobey Maguire e Sam Raimi, segundo os produtores. O filme custou cerca de US$ 250 milhões e teve uma programação de lançamento mundial no mesmo dia - exceto em 16 países três dias antes - para evitar cópias piratas. O elenco original está presente, contando ainda com Topher Grace, de That 70´s Show, e Thomas Haden Church, que trabalhou mais de um ano para construir o personagem do Homem-Areia.